miércoles, 17 de mayo de 2017

DIAGNÓSTICO GENÉTICO EN ANIRIDIA



MEJORANDO EL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ANIRIDIA Y SÍNDROME DE WARG EMPLEANDO CGH-ARRAY PERSONALIZADOS DE ALTA RESOLUCIÓN


 http://www.elsevier.es/es-revista-semergen-medicina-familia-40-articulo-resumen-evolucion-las-tecnicas-citogenetica-S1138359310003199


La mayoría de los casos de aniridia y los síndromes relacionados están causados por una mutación en el gen PAX6 que está en el cromosoma 11. Todos tenemos 23 cromosomas que nos da el padre y 23 que nos da la madre. Un 30% de los pacientes con aniridia presentan reordenamientos complejos del material genético dentro del cromosoma 11, incluyendo deleciones de todo el gen (falta el gen entero), microdeleciones (falta un trozo pequeño del gen) o deleciones genéticas contiguas a PAX6, principalmente de WT1 (asociado al Síndrome de WARG).

Debido a la gran complejidad en los mecanismos involucrados en la aniridia congénita y en los síndromes asociados, la aproximación diagnóstica genética se lleva a cabo combinando diferentes aproximaciones moleculares y citogenéticas:

  1. Secuenciación Sanger para el screening intragenético de mutaciones de PAX6. Lo que se hace es leer la secuencia completa del gen para ver si hay cambios.
  2.  Hibridación Fluorescente In Situ (FISH) para el análisis de microdeleciones intersticiales. FISH es una técnica citogenética por la que se envían unas sondas que emiten fluorescencia y que se unirán al cromosoma que porta mutaciones, lo que permite visualizar y distinguir los cromosomas que presentan mutaciones
  3. Cariotipado convencional o de alta resolución para otros reordenamientos genéticos. Por medio de esta prueba se puede: contar el número de cromosomas y buscar cambios estructurales en los cromosomas. Es una prueba para ver directamente cómo son los cromosomas, lo cual puede ayudar a identificar problemas genéticos en los que falten trozos grandes del cromosoma como sucede en la aniridia. 
  4. Amplificación de Sondas Dependiente de Ligandos Múltiples (MLPA). Es un método basado en la reacción en cadena de la polimerasa (RCP), que permite realizar una cuantificación relativa del número de copias normales y anormales de ácido desoxirribonucleico (ADN) de hasta 40 secuencias genómicas diferentes. Permite un análisis rápido y seguro de deleciones en PAX6 y WT1, pero tiene el inconveniente de que sólo identifica ciertos tipos de reordenamientos. Además no permite la determinación de los límites de las Variaciones del Número de Copias (CNVs) y el mapeo de los puntos de ruptura. Resolver estas limitaciones es crucial para el correcto diagnóstico de deleciones en la región PAX6 en recién nacidos con aniridia esporádica, en los que el análisis de la deleción en el brazo corto del cromosoma 11 (11p13) debería ser prioritario para descartar un síndrome de WARG.
  5.  CGH Array o hibridación genómica comparativa ha demostrado ser una aproximación más sensible para el análisis de las CNVs que las técnicas de MLPA, por ello se están empleando para la detección de estas variaciones en pacientes que presentan discapacidades y/o defectos al nacimiento. El array CGH (también conocido como cariotipo molecular) es una técnica utilizada en diagnóstico genético que nos permite analizar el genoma completo de un individuo en busca de alteraciones de ganancia o pérdida de material genético. Para ello se hace uso de las últimas técnicas en biología y citogenética molecular, evitando realizar cultivos celulares, o bandeo cromosomico con tripsina/giemsa, lo que reduce considerablemente los tiempos de espera para obtener el resultado respecto al cariotipado convencional, siendo además capaz de detectar delecciones (falta de trozos de ADN) o inserciones (introducción anómala de trozos de ADN) con mucha mayor resolución. Aunque muchos autores han establecido la efectividad del análisis de microarrays para el estudio de malformaciones oculares congénitas, muy pocos estudios han llevado a cabo un análisis de las microdeleciones en  11p13 en pacientes con aniridia o síndromes relacionados mediante array-CGH de alta resolución.
  6.  CGH Array de alta resolución. Supone una mejora en la precisión de la identificación de pequeños CNVs y una mejora en el mapeo de los puntos de ruptura. En este estudio se emplea este método para cubrir la región 11p13 para estudiar los reordenamientos en la región genética donde se ubica WARG. 

Las deleciones del brazo corto del cromosoma 11 son frecuentes en los casos de aniridia congénita y en el Síndrome de WARG. El primer nivel para el diagnóstico genético en anirida para detectar reordenamientos del cromosoma 11 incluye: 


  • MLPA (Amplificación de Sondas Dependiente de Ligandos Múltiples)
  •  Cariotipo


Sin embargo ninguna de esas aproximaciones permite obtener una imagen completa de la complejidad de las deleciones y puntos de ruptura cromosómicos en aniridia

En el presente estudio se expone el desarrollo y validación de la técnica: CGH Array personalizados de alta resolución, también conocida como WARG-array, lo que permite un análisis de alta resolución de CNV en el locus de WARG. Esta técnica permitió aumentar el ratio de detecciones en una cohorte española de 38 paciente con aniridia, síndrome de WARG y otras malformaciones oculares, permitiendo caracterizar cuatro casos de aniridia no diagnósticados, y confirmar los hallazgos obtenidos con MLPA en otros cuatro pacientes. Esta herramienta representa una buena estrategia para el diagnóstico genético de aniridia y de los síndromes asociados, permitiendo una detección más precisa de micro CNVs, así como una mejor delimitación de los puntos de ruptura cromosómica. Los resultados subrayan la importancia clínica de llevar a cabo un exhaustivo y preciso análisis de los reordenamientos cromosómicos para pacientes con aniridia, especialmente recién nacidos y aquellos con defectos en PAX6 tras el diagnóstico de screening. Como conclusión los resultados muestran los beneficios del uso de WARG-array, frente a CMA y a MLPA, para mejorar el diagnóstico de aniridia y síndromes relacionados. La utilización de CGH Array personalizados de alta resolución complementa los análisis de rutina clínicos, permitiendo un diagnóstico molecular más preciso y refinado de las microdeleciones de 11p13 e incrementando la detección de reordenamientos cromosómicos en la muestra de pacientes del estudio. 

Artículo original:




domingo, 9 de abril de 2017

TERAPIA CELULAR


En la entrada de hoy el Profesor José Carlos Pastor y la Profesora Isabel Pinilla, oftalmólogos y expertos en el ámbito de la terapia celular, nos dan su opinión en relación al siguiente artículo:

 

Enlace al artículo en la revista de medicina New England Journal of Medicine: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1609583#

“Hace unas semanas saltó a diversos medios informativos nacionales una noticia sobre medicina regenerativa, según la cual tres mujeres norteamericanas se habían quedado “ciegas tras someterse a una terapia con células madre”. La misma hacía referencia a una información del Washington Post, que a su vez citaba un artículo publicado en la prestigiosa revista “The New England Journal of Medicine” cuyo enlace pueden encontrar más adelante.
Dada la transcendencia de estas informaciones nos ha parecido oportuno expresar nuestro punto de vista y agradecemos a la asociación Española de Aniridia habernos permitido utilizar su blog.
Para empezar, el análisis de los hechos deja claro que en estos casos lo que ha habido, fundamentalmente, es un engaño a los pacientes y una secuencia de actuaciones irregulares, que en España serían constitutivas de delito.
Las pacientes, diagnosticadas de Degeneración Macular Asociada a la Edad, fueron sometidas a inyecciones intravitreas de extractos de liposucciones que les hicieron a ellas mismas en una clínica de Florida. Esas pacientes acudieron al centro atraídas por la publicidad que la clínica hacia de haber comenzado un ensayo clínico, registrado en la base de acceso público de ensayos clínicos “ClinicalTrials.gov” en la que debe figurar cualquier ensayo clínico que quiera publicar posteriormente sus resultados en cualquier revista científica.
Pero en realidad el tratamiento al que fueron sometidas no estaba incluido en ningún ensayo, no constaba esa información en el consentimiento informado que firmaron, y las pacientes tuvieron que abonar 5.000  dólares por tratamiento. Así pues la cadena de desgracias que las condujeron a la ceguera se inicio por una simple y vulgar mentira. Además, una de ellas recibió el tratamiento simultáneamente en los dos ojos, lo que supone claramente una actuación temeraria.
En España la ley que regula la investigación biomédica, data de 2007 (Ley 14/2007) y regula cualquier actividad de este tipo, y ya en su preámbulo deja muy claro que “ la salud, el interés y el bienestar del ser humano que participe en una investigación biomédica prevalecerán por encima del interés de la sociedad o de la ciencia”. En particular, la Ley se construye sobre los principios de la integridad de las personas y la protección de la dignidad e identidad del ser humano en cualquier investigación biomédica que implique intervenciones sobre seres humanos, así como en la realización de análisis genéticos, el tratamiento de datos genéticos de carácter personal y de las muestras biológicas de origen humano que se utilicen en investigación.
La ausencia de garantías mínimas exigibles a este tipo de actividades (en España y en la Unión Europea se exige una información adecuada y comprensible a los pacientes y por supuesto la gratuidad de los tratamientos) harían que esas actuaciones médicas se calificaran de infracciones graves, lo que en España lleva asociado las correspondientes sanciones.
O dicho de otra manera, aquí en nuestro país la noticia debería haber aparecido, en mi criterio en las páginas de los tribunales de justicia.
Pero la noticia ya se ha lanzado y suponemos que habrá creado un cierto desasosiego entre los pacientes que estén o vayan a recibir este tipo de tratamientos en un futuro cercano.
Los tratamientos con células madre representan en estos momentos una vía de curación para algunas enfermedades que carecen del mismo y existen suficientes evidencias científicas como para seguir investigando su uso potencial.
De hecho, en la ya mencionada página web, “ClinicalTrials.gov” se puede comprobar que existen varios ensayos clínicos en marcha, cuyos resultados esperamos con enorme interés.
Aquí en España son varios los estudios clínicos de este tipo que se están realizando y hay alguno más que está por venir. Es más algunos grupos llevan más de cinco años utilizando células madre con decenas de pacientes tratados sin complicaciones relevantes.
Es verdad que la perdida de la visión de las pacientes americanas es una desgracia, pero no todo lo que les pasó se puede, ni mucho menos, atribuir al uso de las células madre. Las inyecciones intravitreas son tan frecuentes en estos momentos, que desgraciadamente ya hemos visto, con ellas, algunos problemas serios, que afortunadamente son excepcionales, pero que en alguna rara ocasión pueden comprometer la visión del paciente.
Por otra parte, tal y como se comenta en el New England Journal of Medicine, no parece que existieran garantías en la extracción, manipulación e inyección de las supuestas células madre de origen adiposo, base del tratamiento de esos pacientes.
Así, pues, mi consejo a los futuros pacientes a los que se propongan este tipo de tratamientos es que sigan las recomendaciones de la revista anteriormente citada, que pone el énfasis en aquellos ensayos clínicos, con sólidos fundamentos científicos, con suficiente investigación preclínica, con programas y diseños adecuados y que recelen de cualquier otra actividad.
Y más de uno se estará preguntado: ¿cómo sé yo que la propuesta que me han hecho cumple con esos requisitos? Es fácil, ante la más mínima duda, pida que el investigador que le está ofreciendo ese nuevo tratamiento le enseñe la aprobación del Comité Ético y de Investigación Clínica y la de la Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS).
Con esos dos avales puede estar tranquilo de que en el tratamiento al que se va a someter primará, sobre todo y ante todo, su propia seguridad. Ese es el compromiso de las Autoridades Sanitarias y debería serlo de cualquier investigador. Y si algún médico se “olvida” de estos requisitos, para eso están la ley y los tribunales de justicia."

J. Carlos Pastor
Catedrático de Oftalmología. Universidad de Valladolid.
Jefe de Departamento del Hospital Clínico Universitario de Valladolid.
Grupo de Retina del IOBA.
Coordinador- general de Oftared


"Las células madre son una terapia muy prometedora para las enfermedades retinianas neurodegenerativas, incluyendo las Distrofias Hereditarias de la Retina y la Degeneración Macular Asociada a la Edad, y otras muchas patologías oftalmológicas como el glaucoma y patologías de polo anterior. Hace ya muchos años que James Thompson describió las células madre embrionarias humanas y sin embargo los logros, siendo grandes, son lentos de cara a los pacientes afectos y a los investigadores. Y esta lentitud es solo y exclusivamente con la finalidad de garantizar la seguridad de los enfermos y evitar efectos secundarios indeseables de su uso, como ha sido el caso descrito después de la inyección intravítrea de células grasas del propio paciente.
La Sociedad Internacional para la Investigación en Células Madre (International Society for Stem Cell Research, ISSCR) en unos de sus últimos congresos comunicó una serie de recomendaciones para el uso de células madre en investigación clínica, de las cuales, si las analizamos en profundidad, vemos que la gran mayoría no han sido respetadas en este supuesto ensayo, como ha comentado el profesor Pastor.
Estas recomendaciones son las siguientes:
  1. Un investigador que realiza uso clínico de células madre debe compartir sus conocimientos científicos dando a conocer las características biológicas de las células utilizadas, los estándares de su producción, los datos preclínicos y clínicos obtenidos en cada uso, valorando los riesgos, proporcionado la mayor claridad posible de cara a los posibles beneficios y alternativas terapéuticas para el enfermo, comunicando sus relaciones comerciales y conflictos de interés, monitorizando al paciente de cara a efectos a largo plazo de su uso sobre sus estado de salud y protegiendo su confidencialidad, proporcionando un plan para comunicar efectos secundarios y asegurando al enfermo de cara a posibles riesgos.
  2. Los estudios deben estar aprobados y monitorizados por personal ajeno experto que evalúe los aspectos de la investigación.
  3. La revisión de los ensayos clínicos debe ser apropiada basándose tanto en el trabajo previo in vitro como de los estudios preclínicos in vivo según el correcto proceder de los ensayos clínicos y la ciencia.
  4. Deben identificarse los riesgos y reducirlos al mínimo; los posibles beneficios deben valorarse de modo realista.
  5. Como un principio básico,  la finalidad de la terapia celular debe ser lograr superioridad terapéutica sobre los tratamientos ya existentes. Si no existe una terapia eficaz la gravedad de la enfermedad debe justificar los riesgos de su uso.
  6. La investigación clínica con células madre debe compararse con la mejor terapia existente para tratar a la población.
  7. Los participantes en los ensayos deben estar en posición de beneficiarse de los resultados de la investigación.
  8. El consentimiento informado debe explicar explícitamente todos los riesgos a los que el enfermo se enfrenta y los aspectos específicos de este tipo de tratamiento.
  9. Es necesario monitorizar los datos.
  10. Se debe retirar del ensayo a los enfermos siempre que pueda existir algún riesgo para su seguridad.
  11. En caso de muerte durante el ensayo debe realizarse la autopsia.
  12. Los investigadores deben proporcionar datos sobre las características socioeconómicas de los enfermos, si han recibido algún tipo de compensación económica, y los beneficios y daños resultantes de la participación en el estudio.
  13. Los investigadores deben publicar tanto los resultados positivos como negativos así como los efectos adversos.
Si analizamos uno a uno todos los puntos recogidos en esta guía, comprobamos que en el caso que nos ocupa, se han incumplido muchos de los requisitos exigidos para asegurar el beneficio y bienestar del enfermo, que debe ser siempre el motor de nuestra actuación médica. Desconocemos si la preparación de estas llamadas “células madre” inyectadas en los enfermos fue realizada según los requisitos de “buenas prácticas de fabricación GMP”. Además, de los datos reflejados se aprecia que determinadas sustancias que se emplearon en su preparación, pueden ser nocivas para la retina, como así fueron, provocando toxicidad. Se desconoce si existe una investigación previa clínica que justifique su uso, si se conocía el comportamiento celular intravítreo, sus posibilidades de diferenciación a otro tipo celular, así como tumorogenicidad, si al enfermo se le explicaron otras alternativas, y es evidente que el paciente desconocía el riesgo potencial de la inyección de la suspensión celular.
Y continuando con el resto de los requisitos, el resultado catastrófico del tratamiento nos hace dudar de que el consentimiento informado suministrado al enfermo fuera el adecuado. De que no hubiera otra alternativa mejor. De que se comparara con otros tratamientos. De que el enfermo estuviera en posición de beneficiarse, y de que los datos preclínicos tuvieran consistencia.
Los pacientes que fueron tratados con ese procedimiento, tenían buenas agudezas visuales, con poco margen de mejoría, y se les sometió a un riesgo injustificado siendo el resultado obtenido desastroso y muy  alejado de la historia natural de la enfermedad aun en su peor evolución.

Los investigadores debemos tener en cuenta todas las normas del buen hacer médico, más si se trata de una terapia nueva y con posibles efectos adversos que puedan comprometer al paciente, y los enfermos deben intentar no dejarse engañar por falsas expectativas y ser exigentes con el conocimiento previo, leer con detenimiento el consentimiento informado y conocer los resultados obtenidos, valorando objetivamente las posibilidades de mejoría existente y conociendo que en ocasiones la “medicina” puede moverse por motivos económicos."

Isabel Pinilla
Profesor Titular de Oftalmología. Universidad de Zaragoza.
Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa, Zaragoza.
Instituto de Investigación Sanitaria de Aragón
Coordinadora del sub-proyecto de Retina de Oftared